În noiembrie 1896 Maria Montessori a adăugat ocupaţiilor sale pe aceea de asistent chirurg la Spitalul Santo Spirito din Roma. Mare parte din munca ei era dedicată săracilor şi în special copiilor. Ca medic a fost remarcată pentru felul în care „trata” pacienții, asigurându-se şi că aveau caldură şi erau bine hrăniţi, pe lângă faptul de a fi diagnosticaţi şi trataţi. În anul 1897 a intrat ca voluntar într-un program de cercetare la clinica psihiatrică a Universităţii din Roma, aici lucrând alături de Giusseppe Montesano, de care avea să se îndrăgostească. În anul 1898 munca Mariei Montessori cu copiii insitituţionalizaţi a început să câştige mai multă recunoaştere. La cei 28 de ani de ani ai săi, ea s-a adresat Congresului Medical Naţional din Torino, unde a susţinut teoria controversată conform căreia lipsa îngrijirii adecvate a copiilor retardaţi şi tulburaţi era cauza delincvenţei acestora. Elaborând pe aceeaşi temă, ea s-a adresat Congresului Naţional Pedagogic în anul următor, prezentând o viziune a progresului social şi economiei politice izvorâte din măsuri educaţionale. Acest concept al reformelor sociale prin educaţie s-a dezvoltat şi maturizat în gândirea Mariei Montessori pe tot parcursul vieţii sale.

Implicarea Mariei Montessori în Liga Naţională pentru Educaţia Copiilor Retardaţi a dus la numirea sa în postul de co-director, împreună cu Giusseppe Montesano, al unei noi instituţii numită Şcoala Ortofrenică. Şcoala prelua copii cu un larg spectru de tulburări şi s-a dovedit a fi un punct de cotitură în viaţa Mariei Montessori, schimbând accentul identităţii sale profesionale de la medic la educator. În 1901 Maria Montessori a plecat de la Şcoala Ortofrenică pentru a se dedica propriilor studii de filozofie a educaţiei şi antropologie. În 1904 a acceptat un post de lector la Şcoala Pedagogică a Universităţii din Roma, pe care l-a deţinut până în anul 1908. Într-unul din cursurile sale le-a spus studenţilor: „Subiectul studiilor noastre este umanitatea; scopul nostru este de a deveni profesori. Ei bine, ceea ce defineşte un profesor este iubirea pentru copil; iar că acestă iubire transformă datoria socială a educatorului în conştiinţa mai înaltă a unei misiuni.”